沙门氏菌广泛存在于牛、羊、猪、家禽、鸟类等多种动物的肠道及内脏，并通过粪便传播，可导致人类发烧、肠胃炎、败血症等多种疾病，是世界范围内引起食品公共安全问题的主要食源性致病菌之一。鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）是与人类沙门氏菌病相关的重要血清型，每年在全世界造成约13亿 例胃肠炎、1 600万 例伤寒和300万 人死亡。耐酸反应（ATR）是指沙门氏菌经过温和酸胁迫后，在强酸致死条件下耐受能力增强的现象。沙门氏菌存在多种与ATR相关的调节因子。

　　山东农业大学食品科学与工程学院的杨克慧，董鹏程，朱立贤*等人采用转录组测序（RNA）技术分析酸胁迫（pH 5.4）和非酸胁迫条件下鼠伤寒沙门氏菌转录反应特征，并通过DEGs富集分析阐明鼠伤寒沙门氏菌与酸胁迫相关的生物学途径，进一步明确酸胁迫对鼠伤寒沙门氏菌ATR及其他交叉保护抗性的产生机制，以期为鼠伤寒沙门氏菌在肉制品中的控制提供理论依据。

　　将酸胁迫和非酸胁迫鼠伤寒沙门氏菌在pH 3的强酸条件下进行酸激，其存活率如图1所示，存活率越高，耐酸能力越强。各酸胁迫组的耐酸能力显着高于非酸胁迫组（P＜0.05），表明鼠伤寒沙门氏菌经酸胁迫后能够产生ATR。经pH 5.4和pH 5.0酸胁迫后的存活率分别为33.33%和36.68%，pH 4.5时存活率高达71.72%，显着高于pH 5.4和pH 5.0（P＜0.05）。鲜切番茄和苹果的pH值接近4.5，反映了鲜切水果被沙门氏菌污染后其致病风险的增加，为酸性食品实际生产加工过程中沙门氏菌的防控提供理论基础。为了在恶劣环境下存活，鼠伤寒沙门氏菌必须克服许多复杂的环境胁迫，其中酸胁迫是一个重要的影响因素。不同酸胁迫pH值（5.4、5.0和4.5）处理均能够使鼠伤寒沙门氏菌产生ATR，且生鲜牛肉的极限pH值约为5.4，因此选择pH 5.4的酸胁迫条件开展后续RNA-seq。

　　RNA-seq数据中，将酸胁迫组及非酸胁迫组原始序列进行过滤剔除低质量数据，得到过滤后序列为原始序列的97.60%～99.00%，其错配率低于0.03%， Q 30 比率在93.97%～94.88%之间，GC含量均高于53.60%（表2）。酸胁迫处理组及非胁迫对照组的测序数据准确度较高，可以进行下一步数据分析。

　　以log 2 FC≥1且FDR＜0.05为标准筛选DEGs。酸胁迫组相对于非酸胁迫组共筛选683个DEGs，其中上调基因343个，下调基因340个（图2），从上述结果中筛选部分耐酸相关DEGs进行后续分析。

　　通过Goseq将DEGs注释到GO数据库，得到DEGs可能具有的功能信息，其中GO包括生物过程、细胞组分和分子功能3个维度。如图3所示，经酸胁迫后，DEGs主要富集到生物过程和分子功能。其中生物过程显着富集到运动（GO：0040011）、对外部刺激的反应（GO：0009605）、氧化还原过程（GO：0055114）等，分别富集了19、13个和42个DEGs。分子功能中显着富集到氧化还原酶活性（GO：0016491）、辅因子结合（GO：0048037）等，分别富集到了39个和29个DEGs。细胞组分虽无显着富集的过程，但有较多DEGs富集到膜蛋白复合物（GO：0098796）和细胞质（GO：0005737）中。

　　通过pathway显着性富集得到DEGs参与的信号转导途径，图4为DEGs KEGG富集分析散点图。与非酸胁迫组相比，经酸胁迫后DEGs富集到与全局和总览途径相关的碳代谢（seo01200）、微生物在不同环境中的代谢（seo01120）和次生代谢产物的生物合成（seo01110）等过程，分别富集到28、53个和64个DEGs；与碳水化合物代谢相关的三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA）（seo00020）、磷酸戊糖途径（seo00030）、糖酵解（seo00010）等途径，分别富集到10、13个和8个DEGs；与细胞运动相关的细菌趋化（seo02030）和鞭毛组装（seo02040），分别富集到14个和18个DEGs；与氨基酸代谢相关的谷胱甘肽代谢（seo00480）、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢（seo00260），分别富集到9个和10个DEGs。其他氨基酸代谢如精氨酸和脯氨酸代谢（seo00330）、组氨酸代谢（seo00340）等途径虽无显着富集，但仍有较多DEGs表达上调。

　　结合RNA-seq结果选取10个与耐酸相关的DEGs，以16S rRNA为内参基因，对其进行real-time PCR验证。real-time PCR测定结果与RNA-seq的基因表达趋势一致，Pearson相关系数为0.98，验证了RNA-seq结果的可靠性（图5）。其中与赖氨酸代谢相关的 cadA 、细胞膜组成相关的 ompC 、鞭毛组装相关的 fliC 、细菌趋化相关的 cheA 、交叉保护相关的 katG 和 oxyR 以及双组分调控系统相关的 pmrA 表达上调，其他耐酸相关 nlpD 、 rpoS 和 mgtA 表达下调，表明鼠伤寒沙门氏菌耐酸能力的产生受到多个基因多条通路的调节。

　　本研究根据RNA-seq相关DEGs，结合KEGG pathway富集分析和GO功能注释分别从氨基酸代谢、细胞膜组成、细菌趋化与鞭毛组装、能量代谢、碳水化合物代谢、交叉保护和毒力基因的调控7个方面系统分析影响酸胁迫鼠伤寒沙门氏菌耐酸能力的相关机制（图6）。

　　鼠伤寒沙门氏菌经酸胁迫后赖氨酸代谢系统被激活，赖氨酸脱羧酶基因 cadA 和赖氨酸-尸胺转运蛋白基因 cadB 表达上调，其log 2 FC分别为2.94和2.97（图6）。当赖氨酸代谢系统激活后， cadA 编码赖氨酸脱羧酶使赖氨酸分解为尸胺同时消耗1个质子， cadB 编码尸胺转运蛋白将脱羧产物运出，维持细胞稳定的pH值。

　　此外，经酸胁迫后谷胱甘肽代谢（seo00480）相关基因的表达也出现了变化。谷胱甘肽是细胞活性氧的主要拮抗分子，有两种存在形式，分别为氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）和还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH），GSH在谷胱甘肽-S-转移酶和谷胱甘肽过氧化物酶作用下保护细胞使其免受氧化损伤。与非酸胁迫组相比，经酸胁迫后arcA/B上调了gor（谷胱甘肽还原酶）和trxB（硫氧还蛋白还原酶）的表达，其log2FC分别为1.34和0.95（图6）。这表明鼠伤寒沙门氏菌在酸胁迫过程中经历了氧化损伤，并上调抗氧化相关基因修复酸胁迫造成的细胞损伤，以促进其在酸环境下的生存能力。编码其他氨基酸代谢途径的基因也受到差异调节，特别是脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸以及苏氨酸，这些代谢途径的上调也表明鼠伤寒沙门氏菌在酸胁迫过程中需要大量的营养。

　　HCl由离子的形式存在，主要通过破坏细胞膜及胞内酶对细菌造成伤害。当细胞处于酸性环境中时，细胞膜的完整性和质子动力被破坏，细胞膜功能损伤，导致胞内质子过多，抑制细菌生长。此时鼠伤寒沙门氏菌外膜组分相关基因 ompA 、 ompC 、 ompF 、 ompW 和 ompX 显着上调，其log 2 FC分别为1.86、2.45、1.17、1.15和1.42；内膜组分相关基因 yaiY 、 sfbC 、 gltK 以及其他膜蛋白相关基因 yoaE 也呈现不同程度的上调，其log 2 FC分别为1.60、1.31、1.42和1.43（图6）。细胞膜损伤后，沙门氏菌上调细胞膜结构相关基因的表达，进一步增强鼠伤寒沙门氏菌的耐酸能力。

　　为了适应恶劣的生存环境，鼠伤寒沙门氏菌的磷酸转移酶系统（seo02060，phosphortransferase system，PTS）相关基因呈现不同程度上调。PTS系统是鼠伤寒沙门氏菌碳水化合物积累的主要机制之一，经酸胁迫后ptsI、ptsH、fruF和fruK等基因表达上调，其log 2 FC分别为0.66、1.10、1.49和1.27。PTS系统包含两个胞质磷酸转移酶（酶I和组氨酸磷酸载体蛋白）及糖特异性酶II复合物，其中ptsI编码酶I、ptsH编码组氨酸磷酸载体蛋白。当磷酸化的酶I将磷酸基团转移到组氨酸磷酸载体蛋白上时，磷酸化的组氨酸磷酸载体蛋白又会将磷酸基团传递到细菌中的糖特异性酶II复合物中。最终被转运的碳水化合物经磷酸化转化为糖酵解、磷酸戊糖或TCA途径的磷酸化中间体，这也使得PTS成为高效的传感器和快速的信号转导系统。而鼠伤寒沙门氏菌嘧啶代谢（seo00240）中cmk、yeiA以及nrdA等基因表达下调，其log 2 FC分别为-1.45、-1.00和-1.11，这可能是菌体为降低能量消耗，以维持其他必要代谢途径的方式。

　　呼吸电子传递链（GO：0022904）中nuoK 和fdoI 表达上调，其log2FC分别为1.17、0.59，呼吸链活性的增加使得NADH氧化生成更多的NAD+，NAD+/NADH比率的提高能够调节细胞内质子水平。同时，经酸胁迫后氧化磷酸化（seo00190）相关亚基表达上调，如琥珀酸脱氢酶亚基sdhA（log2FC为1.10）和NADH脱氢酶亚基（nuoN、nuoG、nuoF、nuoK、nuoL、nuoJ，log2FC分别为1.14、1.10、1.18、1.17、1.06和1.20），促进了ATP的合成，并消耗了NADH。编码“物质跨膜转运相结合”的基因表达下调，具体而言，经酸胁迫后编码质子转运ATP合酶的相关基因atpI、rho和atpB显着下调，其log2FC分别为-1.75、-1.32和-1.33。当ATP合酶相关基因下调时，能够减少质子进入菌体内部，从而在一定程度上提高鼠伤寒沙门氏菌的耐酸能力。如果ATP合酶再次将H+离子导入细胞，呼吸链将质子泵出胞浆的效率将在一定程度上被降低。因此，编码ATP合酶的基因下调可以看作是呼吸链消耗质子，以此提高菌株对酸环境的适应。

　　在本研究中，与非酸胁迫组相比，酸胁迫组中TCA（seo00020）的相关酶，如苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、延胡索酸酶和乌头酸酶编码基因mdh、icdA、fumC 及acnA 表达上调，其log2FC分别为1.22、0.88、1.47和1.33，促进了TCA循环的进行，并在有氧条件下产生大量ATP及NADPH。ribH（log2FC为0.99）和2-氧羧酸代谢通路（seo01210）相关基因的上调能够促进乙酰辅酶A的消耗，降低蛋白质乙酰化水平，防止酸胁迫下细胞内pH值进一步下降。TCA循环还能为某些氨基酸在内的多种化合物提供前体。糖酵解（seo00010）是将葡萄糖转化为丙酮酸并释放出能量的过程，经酸胁迫后，参与糖酵解途径的有8个基因显着上调，这表明糖酵解途径参与了鼠伤寒沙门氏菌酸胁迫的适应过程。

　　经酸胁迫后，鼠伤寒沙门氏菌在不同环境中的代谢（seo01120）53个DEGs表达显着上调。当细菌在酸性环境中培养时，细胞膜、蛋白质及DNA都会受到一定程度的损伤。为了减少损伤，鼠伤寒沙门氏菌会增加修复和防御相关基因的表达（图6），如DNA复制和修复相关基因 recA （log 2 FC为1.02），保护大分子使其免受损伤。与耐热相关的基因 danK 、 htrA （log 2 FC分别为1.34和1.02）也表现出一定程度的上调， dnaK 参与蛋白质的复性或分解，并且通过减少错误折迭蛋白质的聚集和促进蛋白质水解防止包涵体的形成。因此，鼠伤寒沙门氏菌经酸胁迫后，与高温抗性相关基因的上调为其耐热性的提高提供了理论支持。 oxyR （log 2 FC为1.06）可以感受氧化胁迫并参与过氧化物代谢和氧化胁迫防御相关基因（ katG 和 sodA 其log 2 FC分别为2.24和0.98）的调控， katG 负责编码过氧化氢酶，对鼠伤寒沙门氏菌在强氧化环境下的存活至关重要。

　　外膜蛋白作为一种结构性毒力因子，其相关基因（详见2.7.2节）表达量的增加会使细菌的毒力增强，侵入巨噬细胞的沙门氏菌还会形成包含小泡（SCV），借助SPI-2产生效应蛋白，阻止SCV与溶酶体融合，以此逃避吞噬作用的杀伤。鞭毛合成因子（fliC、flgL、flgK、fliK、fliY和fliM，其log 2 FC分别为2.07、2.11、1.93、2.07、1.49和0.89）表达上调除了增强运动与趋化能力外，其毒力及黏附入侵能力也显着提高，以帮助鼠伤寒沙门氏菌定植于食物表面或入侵宿主细胞，增加对不利环境的抵抗能力。

　　PmrA/PmrB组分系统是鼠伤寒沙门氏菌重要的双组分调控系统，pmrA（log2FC为0.96）表达上调不仅参与酸环境的适应，还能够调控沙门氏菌的毒力，对脂多糖的修饰有重要作用。脂多糖位于细胞膜外膜的最表面，主要由类脂A、核心多糖和侧链多糖（O抗原）组成，在细菌定植、入侵宿主细胞以及抵御巨噬细胞吞噬作用时起到重要的自我保护作用。与O抗原生物合成酶相关的rfb基因簇（rfbB、rfbD、rfbH、rfbU和rfbI，其log 2 FC分别为-1.61、-1.24、-1.11、-0.90和-0.87）和rfa基因簇（rfaI、rfaG和rfaJ，其log 2 FC分别为-1.37、-1.77和-1.05）相关基因的表达一定程度上下调。而Bai Hong等研究表明，酸应激后肠炎沙门氏菌与毒力相关的rfa、rfb和rfc基因簇相关基因表达上调，与本研究结果相反，这可能与不同血清型的菌株相关，其结果仍有待进一步研究。

　　鼠伤寒沙门氏菌外膜蛋白 和鞭毛相关基因 表达上调，促进了菌株的运动、趋化和细胞膜的稳定性并增强了毒 力，其在酸胁迫下毒力基因高表达的趋势，揭示了人们摄入被沙门氏菌污染的含酸食品会增加其致病性风险。

　　利用RNA-seq技术分析了鼠伤寒沙门氏菌酸胁迫后的基因表达变化。在这683个DEGs中，其中上调基因343个，下调基因340个。酸性环境使得鼠伤寒沙门氏菌胞质内质子过多，为了平衡多余的质子，细胞内NAD+/NADH的比值升高，TCA促进乙酰辅酶A的消耗降低蛋白质乙酰化水平，同时降低ATP合酶的活性。鼠伤寒沙门氏菌的运动能力增强，一些功能基因包括应激反应调控蛋白、膜转运蛋白的上调以修复酸胁迫带来的损伤，促进细胞存活。碳水化合物代谢和PTS等产能系统上调，一些消耗能量的代谢过程下调，以维持细胞膜损伤、DNA损伤修复等必要过程提高鼠伤寒沙门氏菌的耐酸能力。最后，与毒力相关的鞭毛、外膜蛋白以及双组分系统等相关基因的表达上调揭示了鼠伤寒沙门氏菌在酸性环境下致病风险的增加。

　　朱立贤，女，1975年9月出生，山东兖州人，博士，教授，硕士研究生导师。主讲《食品毒理学》、《肉制品工艺学》、《食品免疫学》和《食品有害生物检测与控制技术》。科研主要集中在肉品质与安全控制、肉制品加工等方面。山东省现代农业产业技术体系牛创新团队岗位专家，承担及参与国家863项目、国家自然科学基金、国家肉牛牦牛产业技术体系、国家公益性行业科研专项等多项科研课题；在Meat Science、Food control、Journal of Asian-Australian Animal Science、《食品与发酵工业》等杂志发表科研论文三十余篇；副主编《食品毒理学》、《牛》，参编《冷却牛肉加工技术》等教材专着多部；申请发明专利6 项；获山东省科技进步二等奖1 项。

　　本文《基于转录组学分析酸胁迫影响鼠伤寒沙门氏菌耐酸能力的机理》来源于《食品科学》2022年43卷22期166-174页，作者：杨克慧，董鹏程，刘昀阁，张一敏，毛衍伟，梁荣蓉，罗 欣，朱立贤*。DOI:10.7506/spkx1229-335。点击下方 阅读原文即可查看文章相关信息。

　　Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。